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层流罩:洁净区（室）沉降菌测定操作规程
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层流罩:洁净区（室）沉降菌测定操作规程 |
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分发部门 |
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1.目的:明确洁净区(室)沉降菌的质量控制标准，规范洁净区(室)沉降菌的检验操作方法
2.适用范围：洁净区(室)沉降菌的控制和测试方法，及车间洁净室和洁净区无菌室或无菌区域（包括洁净工作台）的沉降菌的测定和环境的验证。
3.责任者：质量控制部洁净区(室)沉降菌检验操作人员车间QC检验操作人员。
4.操作内容和方法：
4.1.定义：
4.1.1菌落
4.1.1.1细菌培养后，由一个或几个细菌繁殖而形成的一细菌集落，简称CFU，通常用个数表示。
4.1.1.2沉降菌
⑴ 用规定的方法收集到的活微生物粒子，通过专用的培养基，在适宜的生长条件下繁殖到可见的菌落数。
4.2.应对微生物进行动态监测，评估无菌生产的微生物状况。
4.2.1监测方法有沉降菌法、定量空气浮游菌采样法和表面取样法（如棉签擦拭法和接触碟法）等。
4.2.2动态取样应当避免对洁净区造成不良影响。成品批记录的审核应当包括环境监测的结果。
4.2.3对表面和操作人员的监测，应当在关键操作完成后进行。在正常的生产操作监测外，可在系统验证、清洁或消毒等操作完成后增加微生物监测。
4.2.4洁净区微生物监测的动态标准(1)如下：
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洁净度级别 |
浮游菌 cfu/m3 |
沉降菌（f90mm） cfu /4小时(2) |
表面微生物 |
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接触（f55mm） cfu /碟 |
5指手套 cfu /手套 |
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A级 |
<1 |
<1 |
<1 |
<1 |
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B级 |
10 |
5 |
5 |
5 |
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C级 |
100 |
50 |
25 |
－ |
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D级 |
200 |
100 |
50 |
－ |
4.2.4.1表中各数值均为平均值。
4.2.4.2单个沉降碟的暴露时间可以少于4小时，同一位置可使用多个沉降碟连续进行监测并累积计数。
4.3.沉降菌测试操作方法：
4.3.1洁净区沉降菌控制限度：
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洁净度级别 |
沉降菌/皿 |
测定频次 |
洁净度级别 |
沉降菌/皿 |
测定频次 |
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A级 |
≤1 |
1次/日 |
D级 |
≤100 |
1次/月 |
|
C级 |
≤50 |
1次/周 |
4.3.2、测试操作方法：
4.3.2.1本测试方法采用沉降法，即通过自然沉降原理收集在空气中的生物粒子于培养平皿，经若干时间，在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落进行计数，以平板培养皿中的菌落数来判定洁净环境内的活微生物数，并以此来评定洁净区的洁净度。
4.3.2.2所用的仪器和设备
⑴ 高压消毒锅：使用时应严格按照仪器说明书操作。
⑵ 恒温培养箱： 必须定期对培养箱的温度计进行检定。
⑶ 培养皿： 一般采用Ф90mm×15mm的硼硅酸玻璃培养皿。
⑷ 培养基：普通肉汤琼脂培养基（微生物限度检查法）或其他药典认可的培养基。
4.3.3.测试操作步骤：
4.3.3.1采样操作方法：将已制备好的培养皿按4.2.4.2的要求放置，打开培养皿盖，使培养基表面暴露4h，再将培养皿盖盖上后倒置。
4.3.3.2培养。
⑴ 全部采样结束后，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。
⑵ 在30℃--35℃培养箱中培养，时间不少于72h。
⑶ 每批培养基应有对照试验，检验培养基本身是否污染。可每批选定3只培养皿作对照培养。
4.3.3.3菌落计数：
⑴ 用肉眼直接计数，标记或在菌落计数器上点计，然后用5—10倍放大镜检查，有否遗漏。
⑵ 若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上菌落计数。
4.3.3.4.操作注意事项：
⑴ 测试用具要作灭菌处理，以确保测试的可靠性、正确性。
⑵ 采取一切措施防止人为对样本的污染。
⑶ 对培养基、培养条件及其他参数作详细的记录。
⑷ 由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉淀物的区别，必要时用显微镜鉴别。
⑸ 采样前应仔细检查每个培养皿的质量，如发现变质、破损或污染的应剔除。
4.3.4.、测试操作规则。
4.3.4.1测试操作状态。
⑴ 沉降菌测试前，被测试洁净室的温湿度须达到规定的要求，静压差、换气次数、空气流速必须控制在规定值内。
⑵ 沉降菌测试前，被测试洁净室已经过消毒。
⑶ 测试状态有静态和动态两种，测试状态的选择必须符合生产的要求，并在报告中注明测试状态。
4.3.4.2测试人员
⑴ 测试人员必须穿戴符合环境洁净级别的工作服。
⑵ 静态测试时，室内测试人员不得多于二人。
4.3.4.3．测试时间：
⑴ 对单向流，如A级净化房间及层流工作台，测试应在净化空调系统正常运行不少于10min后开始。
⑵ 对非单向流,如C级、D级以上的净化房间，测试应在净化空调系统正常运行不少于30min后开始。
4.3.4.4.沉降菌计数：
⑴ 采样点数目及其布置。
⑵ 最少采样点数目(沉降法的最少采样点数可按表1确定)：。
表1 最少采样点数目
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面 积（M2） |
洁净度级别 |
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A级 |
C级 |
D级 |
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〈10 |
2-3 |
2 |
2 |
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≥10－〈20 |
4 |
2 |
2 |
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≥20－〈40 |
8 |
2 |
2 |
|||
|
≥40－〈100 |
16 |
4 |
2 |
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≥100－〈200 |
40 |
10 |
3 |
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≥200－〈400 |
80 |
20 |
6 |
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≥400－〈1000 |
160 |
40 |
13 |
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≥1000－〈2000 |
400 |
100 |
32 |
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2000 |
800 |
200 |
63 |
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注：表中的面积，对于单向流洁净室，是指送风面面积。对于非单向流洁净室是指房间的面积。 |
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⑶ 在满足最少测点数的同时，还应满足最少培养皿数，见表2
表2 最少培养皿数
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洁净度级别 |
所需Ф90mm培养皿（以沉降4 h计） |
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A级 |
14 |
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C级 |
2 |
|
D级 |
2 |
4.3.4.5.采样点的布置。
⑴ 采样点的位置可以同悬浮粒子测试点,采样点的布置图示如下：
A1洁净棚（层流罩），洁净工作台等局部空气净化设施的采样点布置：
A1.1 水平单向流
A1.2 垂直单向流
⑶ 可在关键设备或关键工作活动范围处增加采样点。
⑵ 工作区采样点的位置离地0.8m—1.5m左右（略高于工作面）。
4.4、记录
4.4.1测试报告中应记录房间温度、相对湿度、压差及测试状态。
4.4.2测试报告的编写见标准的附录
4.5、结果计算。
4.5.1用计数方法得出各个培养皿的菌落数。
4.5.2平均菌落数的计算，见式（1）
M1+M2+…Mn
平均菌落数M=──────……………（1）
n
式中：M----平均菌落数，
M1----1号培养皿菌落数，
M2----2号培养皿菌落数，
Mn----n号培养皿菌落数，
n----培养皿总数。
4.6、结果评定:
4.6.1用平均菌落数判断洁净室空气中的微生物;
4.6.1.1洁净室内的平均菌落数必须低于所选定的评定标准。
4.6.1.2若某洁净区内的平均菌落数超过评定标准，则必须对此区域先进行消毒，然后重新采样两次，测试结果均须合格。
移动式层流罩的安装确认
移动式层流罩机械运行确认
移动式层流罩自净时间的测定
移动式层流罩气流模型测试确认
层流罩测试:模拟生产人员进出箱对气流方向影响试验确认
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