层流罩:洁净区（室）沉降菌测定操作规程

1.目的:明确洁净区(室)沉降菌的质量控制标准，规范洁净区(室)沉降菌的检验操作方法

2.适用范围：洁净区(室)沉降菌的控制和测试方法，及车间洁净室和洁净区无菌室或无菌区域（包括洁净工作台）的沉降菌的测定和环境的验证。

3.责任者：质量控制部洁净区(室)沉降菌检验操作人员车间QC检验操作人员。

4.操作内容和方法：

4.1.定义：

4.1.1菌落

4.1.1.1细菌培养后，由一个或几个细菌繁殖而形成的一细菌集落，简称CFU，通常用个数表示。

4.1.1.2沉降菌

⑴ 用规定的方法收集到的活微生物粒子，通过专用的培养基，在适宜的生长条件下繁殖到可见的菌落数。

4.2.应对微生物进行动态监测，评估无菌生产的微生物状况。

4.2.1监测方法有沉降菌法、定量空气浮游菌采样法和表面取样法（如棉签擦拭法和接触碟法）等。

4.2.2动态取样应当避免对洁净区造成不良影响。成品批记录的审核应当包括环境监测的结果。

4.2.3对表面和操作人员的监测，应当在关键操作完成后进行。在正常的生产操作监测外，可在系统验证、清洁或消毒等操作完成后增加微生物监测。

4.2.4洁净区微生物监测的动态标准(1)如下：

4.2.4.1表中各数值均为平均值。

4.2.4.2单个沉降碟的暴露时间可以少于4小时，同一位置可使用多个沉降碟连续进行监测并累积计数。

4.3.沉降菌测试操作方法：

4.3.1洁净区沉降菌控制限度：

4.3.2、测试操作方法：

4.3.2.1本测试方法采用沉降法，即通过自然沉降原理收集在空气中的生物粒子于培养平皿，经若干时间，在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落进行计数，以平板培养皿中的菌落数来判定洁净环境内的活微生物数，并以此来评定洁净区的洁净度。

4.3.2.2所用的仪器和设备

⑴ 高压消毒锅：使用时应严格按照仪器说明书操作。

⑵ 恒温培养箱： 必须定期对培养箱的温度计进行检定。

⑶　培养皿：　一般采用Ф90mm×15mm的硼硅酸玻璃培养皿。

⑷　培养基：普通肉汤琼脂培养基（微生物限度检查法）或其他药典认可的培养基。

4.3.3.测试操作步骤：

4.3.3.1采样操作方法：将已制备好的培养皿按4.2.4.2的要求放置，打开培养皿盖，使培养基表面暴露4h，再将培养皿盖盖上后倒置。

4.3.3.2培养。

⑴ 全部采样结束后，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。

⑵ 在30℃--35℃培养箱中培养，时间不少于72h。

⑶ 每批培养基应有对照试验，检验培养基本身是否污染。可每批选定3只培养皿作对照培养。

4.3.3.3菌落计数：

⑴　用肉眼直接计数，标记或在菌落计数器上点计，然后用5—10倍放大镜检查，有否遗漏。

⑵　若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上菌落计数。

4.3.3.4.操作注意事项：

⑴ 测试用具要作灭菌处理，以确保测试的可靠性、正确性。

⑵ 采取一切措施防止人为对样本的污染。

⑶ 对培养基、培养条件及其他参数作详细的记录。

⑷ 由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉淀物的区别，必要时用显微镜鉴别。

⑸ 采样前应仔细检查每个培养皿的质量，如发现变质、破损或污染的应剔除。

4.3.4.、测试操作规则。

4.3.4.1测试操作状态。

   ⑴　沉降菌测试前，被测试洁净室的温湿度须达到规定的要求，静压差、换气次数、空气流速必须控制在规定值内。

⑵　沉降菌测试前，被测试洁净室已经过消毒。

⑶　测试状态有静态和动态两种，测试状态的选择必须符合生产的要求，并在报告中注明测试状态。

4.3.4.2测试人员

⑴ 测试人员必须穿戴符合环境洁净级别的工作服。

 ⑵ 静态测试时，室内测试人员不得多于二人。

4.3.4.3．测试时间：

⑴ 对单向流，如A级净化房间及层流工作台，测试应在净化空调系统正常运行不少于10min后开始。

⑵ 对非单向流,如C级、D级以上的净化房间，测试应在净化空调系统正常运行不少于30min后开始。

 4.3.4.4.沉降菌计数：

⑴　采样点数目及其布置。

 ⑵　最少采样点数目(沉降法的最少采样点数可按表1确定)：。

表1    最少采样点数目

⑶ 在满足最少测点数的同时，还应满足最少培养皿数，见表2

表2   最少培养皿数

4.3.4.5.采样点的布置。

⑴ 采样点的位置可以同悬浮粒子测试点,采样点的布置图示如下：

A1洁净棚（层流罩），洁净工作台等局部空气净化设施的采样点布置：

A1.1 水平单向流

A1.2 垂直单向流

⑶ 可在关键设备或关键工作活动范围处增加采样点。

⑵ 工作区采样点的位置离地0.8m—1.5m左右（略高于工作面）。

4.4、记录

4.4.1测试报告中应记录房间温度、相对湿度、压差及测试状态。

4.4.2测试报告的编写见标准的附录

4.5、结果计算。

4.5.1用计数方法得出各个培养皿的菌落数。

4.5.2平均菌落数的计算，见式（1）

                        M1+M2+…Mn

平均菌落数M=──────……………（1）

                             n

式中：M----平均菌落数，

          M1----1号培养皿菌落数，

          M2----2号培养皿菌落数，

          Mn----n号培养皿菌落数，

          n----培养皿总数。

 4.6、结果评定:

4.6.1用平均菌落数判断洁净室空气中的微生物;

4.6.1.1洁净室内的平均菌落数必须低于所选定的评定标准。

4.6.1.2若某洁净区内的平均菌落数超过评定标准，则必须对此区域先进行消毒，然后重新采样两次，测试结果均须合格。