层流罩：HPLC测定药品步骤

目 的：
对于刚接触HPLC的工作人员来说，在实验前感觉有很多事情都要同时去做，且思路不是很清晰。现在，就用十个步骤来说明用HPLC测定药品含量的全过程，供大家参考。
仪 器：
安捷伦1100型HPLC（A、B、C、D四元泵，配200mm的C18柱）
药 品：
头孢噻肟钠（头孢类无菌原料）
关键词：
HPLC、色谱柱、步骤、流动相、基线、平衡、天平、溶解、校正因子、含量测定

第一步：准备工作       
拿到样品，我首先查找该药品的含量检测标准，熟悉实验中用到哪些器具、试剂、工具等。因此，我准备了药勺、镊子、容量瓶、烧杯、滴管、移液管等，并领取工作对照品。
登记对照品领用记录。
在本步骤中应该注意：
1.用到的容量瓶、移液管等均应经计量部门校正合格，并在有效期内使用。
2.我用的对照品是中检所提供。一般的对照品来源有两种，一种是来自中检所，为一级对照品；一种是用中检所对照品标定原料药，用此原料药作为对照品，为二级对照品。

第二步：装色谱柱、冲水
选择药品标准中该品种规定的色谱柱（本实验用200mm的C18柱）接于HPLC，并在仪器A通道上放置新制的超纯水。打开HPLC和工作站，仪器自检完毕后，打开冲洗阀、选择水的连接通道（A通道）、调节流速至3ml/min，约5-8min后，使原来保存在泵前管路内的流动相被水替换，并排走管路内的气泡后，关闭冲洗阀；调节流速至0.5ml/min，并保存此时水的方法，开始用水冲洗色谱柱。理论上，20cm色谱柱的冲洗时间大约为30-40min。在本步骤中应该注意：
1.色谱柱在安装时要注意流向，不要接反。
2.超纯水超的制取，我是从超纯水机中获得；还可以用纯化水经0.45um的水系膜过滤2遍得到。
3.为防止色谱柱内填料被水冲坏，可添加5%-10%的有机溶剂（乙腈或甲醇）。

第三步： 配制流动相（此时HPLC在冲水）
按照标准规定的流动相配制方法，配制该样品的流动相。配置流动相用时30-40min。
登记流动相配置记录。
在本步骤中应该注意:
1.有的HPLC带有真空脱气装置，如安捷伦1100。但也有的仪器没有，如岛津的一些型号，所以在流动相进液相色谱仪前一定要排好气泡。最简单的方法就是超声，一般超声10-15min即可。
2.如果标准方法规定流动相为有机系和水系混合物，如本实验。则流动相在进HPLC前，一定要保证混合均匀，以免在进样后出现前后两针保留时间差别很大的现象。

第四步：走基线
1.把流动相放入HPLC托盘，并用封口膜把流动相管道密封于流动相瓶中，以防止流动相中有机系挥发。
2.按标准方法设置流速、波长、单针运行时间等仪器参数，并保存样品方法、运行方法，平衡系统。
在本步骤中应该注意：
此时水已运行约30-50min，已达到了我们的目的，即把色谱柱内原来的保存液替换为水，以防止原来的保存液和现在的流动相不相容，产生沉淀，损害色谱柱。
理论上平衡系统的时间大约为40min，或以基线是否平稳来判断。
延伸：
在设置方法时，我们要去编辑该药品的方法或直接调用该方法。这里存在一个仪器使用权限的问题。按照cGMP的要求，应该符合3级管理权限，即维护人员权限、管理员权限、操作员权限（有的地方可能介绍的是4级或5级分类，我们要学习的是这种管理仪器的理念。如果有高手清楚可以赐教，在此先感谢！）。操作人员只有调取方法的权限，是没有更改或新建方法方法权限的。仪器管理员有分配操作人员调用方法和更改不适用方法的权限。但我们在液相上还很难做到这一点。但在我们新购入的TOC（总有机碳）测定仪上就实现了这个权限的分配。

第五步：称量（此时的HPLC在走基线）
首先按照称样量的大小选择合适的砝码校正天平，然后开始正式称量。此过程用时15-20min。
登记天平使用记录。
在本步骤中应该注意：
1.称取的样品分别为系统适应性样品（对照品+杂质或对照品加速实验得到）、对照品、样品等；可以使用减量法或直接称量法称取；称量的范围应按照药典规定的精密称量标准。
2.称量完毕，天平归零、打印出称量数据并清理天平周围的卫生。
延伸：
在称量过程中，样品暴露于空中，噻肟药粉会漂浮在空气中，这是过敏源。因此，这一步的操作应该是在密封的层流罩内进行。但我们还没有做到，因为国内还没有厂家能做出在层流罩下使用十万分子一电子天平的这套装置。（这一点不知道国外是怎么做的？如果有高手知道可以赐教，在此先感谢！）

第六步：样品溶解（此时的HPLC在走基线）
用烧杯盛装标准方法规定的溶剂，溶解样品。本实验用的是水，我直接从超纯水机获取。本过程用时20-30min。
在本步骤中应该注意：
正确使用移液管，并按要求定容。如果标准方法规定，配好的样品应立即进样或保存在一定温度下，则应该严格按要求操作。
按照上一步末尾提出的问题，此步骤仍然要在密封的层流罩内进行，以防止过敏源的扩散。

第七步：设置工作站样品表（此时的HPLC在走基线）
在样品表中设置每个样品在样品盘中的位置、样品批号、进样针数、称样量，并调用已设置好的样品方法到样品表。
在设置样品最后一针后，调入水（A通道，方法为：0.5ml/min、运行60min）和乙腈（B通道，方法为：0.5ml/min、运行120min）的方法，目的是进样完毕后先用水冲洗色谱柱内的流动相，后用乙腈保存色谱柱。保存样品表。

第八步：放样
把容量瓶中的供试液和对照液分别装入样品瓶，按已编制样品表中的顺序放入样品盘。

第九步：进样
选择合适的报告储存路径并判断基线稳定后，点击开始进样。
在本步骤中应该注意：
此时进样，流动相已运行约50min，系统也已平衡。如果运行前看到基线不稳，说明系统还未平衡，还需继续运行流动相。
进样后，有关液相操作的工作就完成了，剩下的是进样完毕后打印图谱。

第十步：处理剩余样品、打印图谱、计算含量
整个实验完成后，把用过的玻璃器具归到待清洗区域。进样完毕，打印色谱图，计算含量，整理好实验记录后，把记录交于下个检验工序的化验员。
在此过程应该注意：
1.由对照品图谱主峰面积（5针）计算出校正因子的平均值和RSD（相对标准偏差），药典中的要求是小于2%，我们内部控制为小于0.5%。根据样品图谱主峰面积，把校正因子和水分带入公式，即可计算含量。
2.如果记录上填写数据错误，应该用单线或双线划掉，在其上方或下方写下正确的数据，并在旁边签字、日期。
3.由于实验的对象是头孢类物品，因此，已经溶解而未用尽的样品应倒入强碱罐内灭活；未用尽得粉末统一回收。
总结：
个人认为按照这十步骤操作HPLC简单且省时、省力，主要在于：在点击样品运行后，我们可以去做其他实验，这也是自动进样器的优点；在用水冲洗色谱柱时，配置样品的流动相；在走基线时，称量样品。这样操作能节省很多时间。在文中提到的时间段，只是我个人在操作过程的记时。实验过程中，根据个人对实验熟练的程度，各个步骤的用时会有所变动，但只要顺序不变同样能达到省时、省力的目的。

备注：
1.运行时间计算：
根据方法设置里面单针运行时间、总进针数来判断。按此试验：对照品称取2份，共进5针；样品称取7个样，每个样2份，各进1针，共14针。样品单针运行12min，共进5+14=19针，用时为：12×19=228min。
2.流动相配制量计算：
样品单针运行12min，共进19针，流速为1.2ml/min，那么共消耗的流动相为：12×19×1.2=273.6ml，加上前期平衡系统运行约40min，即40×1.2=48ml，共需要流动相273.6+48=321.6ml。我实际配置1000ml，剩余部分可在下次实验时继续用。但应注意，流动相应在有效期内使用。